大/小鼠甘肃灌注方法参考

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一,实验原理

      在实验动物组织病理学实验研究中，特别是进行甘肃原位杂交和免疫组化研究，为避免或减少死后组织形态及结构发生变化，常于动物处死前，采用灌注固定法。灌注固定即通过血管途径将固定液导入所需固定的组织器官内，将活的细胞在原位及时迅速固定，再摘取样品。

      心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死之前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变,从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

二、灌注的必要性

灌注的必要性：

①脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好在取脑组织前用甘肃4%多聚甲醛灌注固定；

②经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；

③脑内血液丰富，经灌注后，可去除红细胞。

三、灌注方法（心脏灌注法）

心脏灌注原理：

心脏灌注术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象，是脑组织切片观察的常用方法。

心脏灌注方法：

   先把老鼠麻醉，沿胸骨柄剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏，与心尖呈30-45°夹角剪开左心室，将灌注针从左心室插入主动脉，固定针头，再剪开右心耳，然后快速用生理盐水（大鼠100-150ml）冲洗血液，至流出液体血色较浅基本澄清（肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排除血液的有效观察标志），再先快后慢注入4%多聚甲醛250ml（大鼠）固定，先后所需50min，多聚甲醛进入大鼠体内，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。然后取材，取完后的脑组织再放置4%多聚甲醛中4度冰箱进行后固定，时间12-24小时。

四、注意事项

1.暴露心脏这一步，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑突并向上提拉，用弯剪再膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸”人工气胸后，肺萎缩，胸腔里的空间增大，提拉剑突就不容易损伤肺、心脏及肝脏，出血少。

2.经心脏灌注，有时穿刺会误进右心室，那样灌注主要再肺循环起作用，体循环的血液影响不大。所以将穿刺针插入到主动脉内才可以确保起到体循环灌注冲洗血液的效果，脑组织的血液冲干净后，才不会影响免疫组化的效果，不然到处都是红细胞造成的背景染色。

3.灌注时注意排空输液管中的气泡，不然容易血栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。

4.灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一条直线；所灌注的脑组织白而硬。

5.去颅骨后脑表面有一层硬脑膜，要去掉。

6.小鼠的灌注液用量：生理盐水20-30ml，多聚甲醛20ml左右。

五,常见问题

1.没有灌注固定取材的组织能不能做切片和免疫荧光/组化染色？

答:如果没有灌注固定，而是直接取材然后放固定液中可以进行组化/荧光染色，但是效果没有灌注固定的效果好。

2.组织取材固定了几个月了,对组化/荧光实验有无影响?

答:固定时间过长组织样本,蛋白多肽链交联在一起,抗原性变弱，很可能没有阳性结果，当组织抗原比较低时就很难把抗原性修复。所以组织固定时间长，就应该调整抗原修复时间或修复条件。

3,多聚甲醛灌注过的组织是否可以用于Western blot及PCR实验检测?

答:多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变,所以如果做后续取材做Western blot及PCR检测不建议多聚甲醛灌注,可以适当使用生理盐水或含酶抑制剂或RNA保护剂的短暂灌注.或者分两组动物进行实验：一组灌注固定（用于形态学），另一组不灌注.（直接取材做WB/PCR）

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